Według współczesnych relacji James przez kilka miesięcy przed śmiercią źle się czuł, cierpiał na różne objawy, w tym ból w klatce piersiowej, duszność i problemy trawienne. Miał także okresy nieobliczalnego zachowania i depresji. 21 marca 1625 roku Jakub doznał ciężkiego udaru, w wyniku którego został sparaliżowany po lewej stronie ciała. Nie mógł mówić ani się poruszać, a jego stan szybko się pogarszał.
James zmarł sześć dni później w otoczeniu rodziny i doradców. Został pochowany w Opactwie Westminsterskim 5 kwietnia 1625 roku. Na tron wstąpił po nim jego syn Karol I.
Chociaż dokładna przyczyna śmierci nie jest znana, uważa się, że na śmierć Jamesa złożyło się kilka czynników, w tym pogarszający się stan zdrowia, udar i gorączka trzeciorzędowa. Niektóre współczesne relacje sugerują również, że James mógł zostać otruty, ale nie ma konkretnych dowodów na poparcie tego twierdzenia.