Samce i samice żółwi pudełkowych wyglądają bardzo podobnie. Jak u wielu gadów i płazów, ich narzędy rozrodcze nie są widoczne, co utrudnia rozpoznawanie płci nieświecemu oku. Istnieją jednak inne cechy – kolor ciała, oczy, skorupa, pazury i ogon – które pozwalają na pewne określenie płci.
Kolor ciała
Podobnie jak u wielu zwierząt, samce żółwi pudełkowych są zazwyczaj bardziej kolorowe od samic. Dotýczy to szczególnie oznak na głowie i przednich nogach. Jeśli żółw jest w głównej mierze brązowy z matowymi żółtymi lub pomarańczowymi plamami, to prawdopodobnie samica. Jeśli posiada wiele jaskrawych pomarańczowych, żółtych, czarnych lub białych plam na głowie lub nogach, może to być samiec. Należy zachować ostrożność – różnice bywają subtelne.
Oczy
Oczy to często najłatwiejszy sposób na rozpoznanie płci. Dojrzałe samice zazwyczaj mają ciemnobrązowe lub pomarańczowo-brązowe oczy. Samce z kolei często mają czerwone lub głęboko pomarańczowe.
Skorupa
Skorupa składa się z dwóch części: górnej (karapaks) i dolnej (plastron). Obie różnią się w zależności od płci. Karapaks samca jest zazwyczaj płaski, podczas gdy u samicy bardziej przypomina pół kulę. Plastron samca może mieć wklęsłe miejsce, u samicy jest zawsze płaski.
Pazury
Tyłowe pazury wschodnich i zachodnich żółwi pudełkowych różnią się w zależności od płci. Samce mają grubsze, zakrzywione pazury, samice – cienkie i proste.
Ogon
Ogon samca jest zazwyczaj dłuższy i grubszy u podstawy, a kloaka (otwór odchodowy) znajduje się dalej od ciała, poza obręb skorupy. U samicy ogon jest krótszy, a kloaka blisko ciała, w obrębie skorupy.